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Real-Time PCR快速反应液(探针法)利用序列特异性探针，可对DNA进行快速、灵敏的Real-Time PCR定量检测。优化的预混液使PCR的运行时间缩短60%以上。

2×QuickFire Probe qPCR Mix为即用型预混液，含有热启动酶和独特的PCR缓冲液，确保在任何Real-Time PCR仪上均可进行灵敏的定量PCR检测。

• 2×QuickFire Probe qPCR Mix采用了特异的抗体修饰热启动DNA聚合酶，配合精心优化的Buffer体系，使PCR反应时间比一般qPCR缩短60%，并且具有定量准确，扩增效率高，重复性好和宽广的可信范围的特点。
  
• 本制品经过优化使荧光信号的释放达到优良的效果，同时充分降解了探针荧光淬灭基团的信号释放，用相同量的模板将得到更强的信号。
  
• 本制品为2×浓度的预混液形式，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、探针、灭菌蒸馏水便可进行Real-Time PCR反应，操作简单方便。
  
• 本制品附带ROX Reference Dye，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，方便客户针对不同型号荧光定量PCR仪时选择对应浓度使用。

收到本制品后，请立即置于-30～-15℃避光保存。从-30～-15℃取出使用时，将冻存的QuickFire Probe qPCR Mix和ROX Reference Dye融解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用，须彻底混匀后重新冷冻。(在解冻过程中盐会出现分层现象，未混匀进行冷冻，盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用，可在2～8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。

本制品采用了特异的抗体修饰热启动DNA聚合酶进行PCR扩增，通过在PCR反应液中加入荧光探针，然后检测反应进程中的荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。

• 本制品中特异的抗体修饰热启动DNA聚合酶，95℃条件下孵育1min即可激活全部酶活，同时配合精心优化Buffer体系，可大大缩短变性、退火和延伸时间，使PCR总运行时间缩短60%，更快获得实验结果，而不影响PCR反应效果，并且具有定量准确，扩增效率高，重复性好和宽广的可信范围的特点。
  
• 本制品针对cDNA模板和gDNA模板结构组成的差异，对PCR的反应步骤进行了特别的优化，使较难扩增的gDNA模板也能获得良好的PCR结果。
  
• 本制品经过优化特别有利于Taq酶发挥其5'-3'外切酶活性，使荧光信号的释放达到优良的效果。此外QuickFire Probe qPCR Mix体系也充分降解了探针荧光淬灭基团的信号释放，经过上述优化，用相同量的模板将得到更强的信号。

• 建议PCR反应的预变性条件，对于cDNA模板，设定为95℃ 30-60 s；对于gDNA模板，设定为98℃ 1～2min，用以激活热启动酶，并使模板解链充分。
  
• 如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀，请不要使用振荡器进行混匀，尽量避免出现泡沫，并经瞬时离心后使用。
  
• 本制品中不含有荧光探针。
  
• 引物终浓度为300 nM，探针终浓度为200 nM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。
  
  • 需要进一步优化引物浓度的，可以在50～900 nM范围内调整；
    
  • 需要进一步优化探针浓度的，可以在50～250 nM范围内调整。
• 20μL反应体系中，基因组DNA或cDNA模板的使用量一般小于100ng，逆转录产物作为模板时，使用量应不超过PCR体系终体积的20%。

• 建立Real-Time PCR反应体系：
  
  • 融解2×QuickFire Probe qPCR Mix(如果保存-30～-15℃)、ROX Reference Dye、模板、引物、探针和RNase-Free ddH2O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀。
    
  • 建议置于冰上进行Real-Time PCR反应液的配制。
    

    成分	50μL体系	25μL体系	20μL体系	终浓度
    2×QuickFire qPCR PreMix	25μL	12.5μL	10μL	1×
    正向引物(10μM)	1.5μL	0.75μL	0.6μL	300 nM
    反向引物(10μM)	1.5μL	0.75μL	0.6μL	300 nM
    荧光探针(10μM)	1.0μL	0.5μL	0.4μL	200 nM
    DNA模板	－	－	－	≤200ng
    50×ROX Reference Dye	－	－	－	－
    RNase-Free ddH2O	至50μL	至25μL	至20μL	-

    • 引物终浓度为300 nM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发生非特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的，可以在50～900 nM范围内调整。
      
    • 探针的浓度与使用的Real-Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用说明进行。通常探针终浓度为200 nM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。需要进一步优化探针浓度的，可以在100～500 nM范围内调整。
      
    • 几种常见仪器的匹配ROX Reference Dye浓度见下表：
      

      仪器	终浓度
      ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/Step One等	5×(例如：5μL ROX/50μL体系)
      ABI 7500、7500 Fast；Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等	1×(例如：1μL ROX/50μL体系)
      Roche仪器，Bio-Rad仪器，Eppendorf仪器等	不用添加

• 进行Real-time PCR反应：
  
  • 建议采用两步法PCR反应程序进行反应；若模板量较低等因素导致扩增效果不佳，可使用三步法程序进行PCR反应。
    
    • 两步法反应程序：
      

      阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
      预变性	1	95℃△1	1min	预变性	否
      PCR反应	40	95℃△1	5sec	变性	否
      		60℃△2	15sec△3	退火/延伸	是

    • 三步法反应程序：
      

      阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
      预变性	1	95℃△1	1min	预变性	否
      PCR反应	40	95℃△1	5sec	变性	否
      		50～60℃△4	10sec	退火	否
      		72℃	15sec△3	延伸	是

    注^△1：以cDNA模板时为预变性温度为95℃，以基因组DNA为模板时为98℃。
    注^△2：请先使用60℃ 15sec进行扩增。如果需要进一步优化，可以尝试在56～66℃范围内进行。
    注^△3：使用不同型号仪器进行时间设定时，请按照仪器使用说明书要求进行实验操作，几种常见仪器的时间设定见下表：
    

    使用Roche，ABI 7500 Fast，BioRad和Agilent等公司荧光定量PCR仪时请设定在15sec。

    使用ABI 7900HT/7900HT Fast/ViiA 7/StepOne/StepOnePlus时请设定在20sec。

    使用ABI 7000和7300时请设定在31sec。

    使用ABI7500时请设定在32sec。

    注^△4：通常引物退火温度比引物的解链温度(Tm)低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度。
    
  • 盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有组分均在管底。
    
  • 将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应。